24 de septiembre

El jueves 24 hicimos preparamos un gel de bisacrilamida para la realizacion de una corrida electroforetica. Ademas adriana nos explico teoria acerca de este metodo, y nos metimos de lleno en el estudio de la teoria de la preparacion y utilizacion del gel de poliacrilamida, y de bisacrilamida. Por otra parte, realizamos una segunda PCR, con su respectiva purificacion. Tambien continuamos pasando en limpio todos los metodos que utilizamos.

Adriana se va a un congreso en Venezuela, por lo que los jueves 1/10 y 8/10 Shari y yo no concurriremos al Castex, siendo el 15/10 la proxima vez que vamos.

Jueves 17/09

En esta jornada, estudiamos un poco mas de teoria acerca de otro metodo de cuantificacion de ADN: la espectrofotometria de UV.
Por otra parte, extrajimos ADN de 4 muestras ( 2 normales ) para su posterior analisis. En una de las muestras no se registro producto, por lo que volveremos a extraer el ADN genomico. Siempre nos manejamos con el metodo de extraccion comercial.

Por otra parte, hicimos una PCR con 8 productos de extraccion, y el resultado del proceso, lo purificamos y lo mandamos al termociclador, en lo que es la segunda PCR, la nested. Luego, lo obtenido lo purificaremos y lo secuenciaremos, observando los resultados esperados en la lectura del esferograma.

Esto fue lo realizado en el dia de hoy.

Saludos

Espectrofotometria de UV para oligonucleotidos

Aca les dejamos el protocolo con el que nos manejamos para medir la absorbancia (y de tal manera, la cc) de los oligonucleotidos, ya sea ADN doble o simple cadena o ARN.


Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.
1. Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamineto y seleccionar la longitud de onda a 230 y 260nm
2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
3. A 990 µl de agua bidestilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.
4. Leer la absorbancia a 230 y 260nm de la muestra

NOTA:
- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.
- El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima) está influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra.

Jueves 10 de septiembre

Durante este día hicimos:
-Realizamos un gel de Acrilamida piperasina para método de CSGE
-Desarmamos un gel del día anterior, lo fijamos y lo revelamos.
-Realizamos una electroforesis de agarosa al 1% para ver la integridad de ADN genómico.
-Sembramos 8 microlitros de muestra en el gel de acrilamida piperasina


más adelante explicaremos el método de CSGE

saludos

Shati y Gaby

Jueves 3 de septiembre

Durante este ultimo jueves sembramos una electroforesis en gel de agarosa, y visualizamos sus resultados en el transiluminador UV. Como no habia producto mandamos a la PCR dos normales de ADN para comprobar que haya (ADN genomico). Ademas preparamos un nuevo gel de agarosa.
Por último, comenzamos a repasar todos los analisis genotipicos y fenotipicos que se suelen llevar a cabo para el estudio de la enfermedad de Von Willebrand, de los cuales vinimos haciendo a lo largo de estos meses los genotipicos sobre todo. "Pasamos en limpio" los analisis, tomando nota y sacandonos algunas dudas.

Saludos

Extraccion de ADN

Extracción de ADN:
Esta técnica consiste en extraer ADN a partir de glóbulos blancos de sangre entera humana. Para ello se utilizan equipos comerciales de probada calidad.

Protocolo:

1. Insertar 300 µl de muestra de sangre, junto con 900 µl de solución de lisis de globulos rojos y mezclar por inversión; esto se realiza con el objetivo de quedarnos solo con los globulos blancos. Vortexear.
2. Centrifugar por 1 minuto a 14500 rpm
3. Descartar el sobrenadante.
4. Agregar 300 µl solución de lisis de globulos blancos y procurar disolver bien. Romper el coagulo de globulos blancos con pipeta.
5.Agregar la solución desproteinizadora en un volumen de 100 µl y vortexear durante 20 segundos.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
7. Pasar el sobrenadante a otro tubo con isopropanol (300 µl). De esta manera precipita el ADN.
8. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
9. Descartar el sobrenadante; agregar 300 µl de etanol 70% con el objetivo de lavar el ADN. Vortexear.
10. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
11. Sacar el etanol mediante el uso de la centrifugadora en vacío durante 10-15 minutos; o bien dejándolo media hora en la estufa a 37ºc.
12. Rehidratar el ADN con 100 µl de la solución de rehidratación de ADN.
13. Llevar 1 hora a 65ºC o bien toda una noche a 4ºC.