Este jueves 12/11 fue nuestra ultima jornada en el Instituto, en la que nos dedicamos a finalizar el power point para el coloquio y la presentacion. El martes 17 sera la presentacion de nuestro proyecto.
Queremos agradecerle tanto a la Dra. Lazzari como a la bioq. Adriana Woods,la posibilidad de realizar nuestro proyecto final ahi y por el trato recibido asi como a toda la division quimica del Instituto de Investigaciones Hematologicas Dr. Mariano R. Castex.
Muchas gracias por todo!
Saludos
Nos vemos el martes
13 de noviembre de 2009
6 de noviembre de 2009
5/11/2009
Este jueves empezamos a encarar la finalizacion de nuestra monografia, compaginandola y corrigiendo errores, no hicimos nignuna prueba.
Saludos
Saludos
29 de octubre de 2009
Jueves 29-10-2009
En el dia de la fecha, continuamos enfocando el trabajo de lleno en la realizacion de la monografia final, repasando cada uno de los metodos con los que trabajamos durante el año, asi como tambien pasando en blanco la fisiologia de la hemostasia.
Cabe destacar, que nos encontrabamos buscando 50 pacientes normales,que no posean el mismo cambio en el exon 28 que el paciente inicial que se presento en el servicio con antecedentes de hemorragia; es por ello que pudimos definir el cambio como un polimorfismo, adjudicandole al mismo el problema que posee el paciente, definiendo su enfermedad como VWD tipo 2 A.
Gaby y Shari
Cabe destacar, que nos encontrabamos buscando 50 pacientes normales,que no posean el mismo cambio en el exon 28 que el paciente inicial que se presento en el servicio con antecedentes de hemorragia; es por ello que pudimos definir el cambio como un polimorfismo, adjudicandole al mismo el problema que posee el paciente, definiendo su enfermedad como VWD tipo 2 A.
Gaby y Shari
26 de octubre de 2009
jueves 22
Durante este jueves, presenciamos un atenéo, en el cual una sección del Instituto presentaba su actual investigación, y los doctores exponian sus opiniones acerca de ello.
A su vez, realizamos un gel agarosa y lo sembramos; por último, le dedicamos un amplio tiempo a la continuación de la monografia a entregar el 11/11.
Saludos
Shar y Gaby
A su vez, realizamos un gel agarosa y lo sembramos; por último, le dedicamos un amplio tiempo a la continuación de la monografia a entregar el 11/11.
Saludos
Shar y Gaby
16 de octubre de 2009
Jueves 15 de octubre
En esta jornada, nos enfocamos en el informe del proyecto final.
Además de continuar con su realización, repasamos con la ayuda de Adriana, cáda anlálisis fenotípico realizado, de modo de recordar cuál eran las características principales de cada uno, y su objetivo.
A su vez, estuvimos leyendo diferentes papers, por lo que pudimos sumarle más información de la enfermedad a los conocimientos que habíamos adquirido sobre la misma.
Además de continuar con su realización, repasamos con la ayuda de Adriana, cáda anlálisis fenotípico realizado, de modo de recordar cuál eran las características principales de cada uno, y su objetivo.
A su vez, estuvimos leyendo diferentes papers, por lo que pudimos sumarle más información de la enfermedad a los conocimientos que habíamos adquirido sobre la misma.
30 de septiembre de 2009
24 de septiembre
El jueves 24 hicimos preparamos un gel de bisacrilamida para la realizacion de una corrida electroforetica. Ademas adriana nos explico teoria acerca de este metodo, y nos metimos de lleno en el estudio de la teoria de la preparacion y utilizacion del gel de poliacrilamida, y de bisacrilamida. Por otra parte, realizamos una segunda PCR, con su respectiva purificacion. Tambien continuamos pasando en limpio todos los metodos que utilizamos.
Adriana se va a un congreso en Venezuela, por lo que los jueves 1/10 y 8/10 Shari y yo no concurriremos al Castex, siendo el 15/10 la proxima vez que vamos.
Adriana se va a un congreso en Venezuela, por lo que los jueves 1/10 y 8/10 Shari y yo no concurriremos al Castex, siendo el 15/10 la proxima vez que vamos.
17 de septiembre de 2009
Jueves 17/09
En esta jornada, estudiamos un poco mas de teoria acerca de otro metodo de cuantificacion de ADN: la espectrofotometria de UV.
Por otra parte, extrajimos ADN de 4 muestras ( 2 normales ) para su posterior analisis. En una de las muestras no se registro producto, por lo que volveremos a extraer el ADN genomico. Siempre nos manejamos con el metodo de extraccion comercial.
Por otra parte, hicimos una PCR con 8 productos de extraccion, y el resultado del proceso, lo purificamos y lo mandamos al termociclador, en lo que es la segunda PCR, la nested. Luego, lo obtenido lo purificaremos y lo secuenciaremos, observando los resultados esperados en la lectura del esferograma.
Esto fue lo realizado en el dia de hoy.
Saludos
Por otra parte, extrajimos ADN de 4 muestras ( 2 normales ) para su posterior analisis. En una de las muestras no se registro producto, por lo que volveremos a extraer el ADN genomico. Siempre nos manejamos con el metodo de extraccion comercial.
Por otra parte, hicimos una PCR con 8 productos de extraccion, y el resultado del proceso, lo purificamos y lo mandamos al termociclador, en lo que es la segunda PCR, la nested. Luego, lo obtenido lo purificaremos y lo secuenciaremos, observando los resultados esperados en la lectura del esferograma.
Esto fue lo realizado en el dia de hoy.
Saludos
Espectrofotometria de UV para oligonucleotidos
Aca les dejamos el protocolo con el que nos manejamos para medir la absorbancia (y de tal manera, la cc) de los oligonucleotidos, ya sea ADN doble o simple cadena o ARN.
Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.
1. Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamineto y seleccionar la longitud de onda a 230 y 260nm
2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
3. A 990 µl de agua bidestilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.
4. Leer la absorbancia a 230 y 260nm de la muestra
NOTA:
- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.
- El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima) está influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra.
Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido.
1. Encender 20 min la lámpara de UV en el espectrofotómetro para su calentamineto y seleccionar la longitud de onda a 230 y 260nm
2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de referencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento).
3. A 990 µl de agua bidestilada en un tubo de 1.5ml, agregar 10µl de solución de oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó para el blanco.
4. Leer la absorbancia a 230 y 260nm de la muestra
NOTA:
- A 260nm, el DNA debe mostrar una absorbancia máxima.
- El valor de la lectura a 230nm (longitud de onda mínima) está influenciado por la cantidad de sales presentes en la muestra.
13 de septiembre de 2009
Jueves 10 de septiembre
Durante este día hicimos:
-Realizamos un gel de Acrilamida piperasina para método de CSGE
-Desarmamos un gel del día anterior, lo fijamos y lo revelamos.
-Realizamos una electroforesis de agarosa al 1% para ver la integridad de ADN genómico.
-Sembramos 8 microlitros de muestra en el gel de acrilamida piperasina
más adelante explicaremos el método de CSGE
saludos
Shati y Gaby
-Realizamos un gel de Acrilamida piperasina para método de CSGE
-Desarmamos un gel del día anterior, lo fijamos y lo revelamos.
-Realizamos una electroforesis de agarosa al 1% para ver la integridad de ADN genómico.
-Sembramos 8 microlitros de muestra en el gel de acrilamida piperasina
más adelante explicaremos el método de CSGE
saludos
Shati y Gaby
4 de septiembre de 2009
Jueves 3 de septiembre
Durante este ultimo jueves sembramos una electroforesis en gel de agarosa, y visualizamos sus resultados en el transiluminador UV. Como no habia producto mandamos a la PCR dos normales de ADN para comprobar que haya (ADN genomico). Ademas preparamos un nuevo gel de agarosa.
Por último, comenzamos a repasar todos los analisis genotipicos y fenotipicos que se suelen llevar a cabo para el estudio de la enfermedad de Von Willebrand, de los cuales vinimos haciendo a lo largo de estos meses los genotipicos sobre todo. "Pasamos en limpio" los analisis, tomando nota y sacandonos algunas dudas.
Saludos
Por último, comenzamos a repasar todos los analisis genotipicos y fenotipicos que se suelen llevar a cabo para el estudio de la enfermedad de Von Willebrand, de los cuales vinimos haciendo a lo largo de estos meses los genotipicos sobre todo. "Pasamos en limpio" los analisis, tomando nota y sacandonos algunas dudas.
Saludos
3 de septiembre de 2009
Extraccion de ADN
Extracción de ADN:
Esta técnica consiste en extraer ADN a partir de glóbulos blancos de sangre entera humana. Para ello se utilizan equipos comerciales de probada calidad.
Protocolo:
1. Insertar 300 µl de muestra de sangre, junto con 900 µl de solución de lisis de globulos rojos y mezclar por inversión; esto se realiza con el objetivo de quedarnos solo con los globulos blancos. Vortexear.
2. Centrifugar por 1 minuto a 14500 rpm
3. Descartar el sobrenadante.
4. Agregar 300 µl solución de lisis de globulos blancos y procurar disolver bien. Romper el coagulo de globulos blancos con pipeta.
5.Agregar la solución desproteinizadora en un volumen de 100 µl y vortexear durante 20 segundos.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
7. Pasar el sobrenadante a otro tubo con isopropanol (300 µl). De esta manera precipita el ADN.
8. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
9. Descartar el sobrenadante; agregar 300 µl de etanol 70% con el objetivo de lavar el ADN. Vortexear.
10. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
11. Sacar el etanol mediante el uso de la centrifugadora en vacío durante 10-15 minutos; o bien dejándolo media hora en la estufa a 37ºc.
12. Rehidratar el ADN con 100 µl de la solución de rehidratación de ADN.
13. Llevar 1 hora a 65ºC o bien toda una noche a 4ºC.
Esta técnica consiste en extraer ADN a partir de glóbulos blancos de sangre entera humana. Para ello se utilizan equipos comerciales de probada calidad.
Protocolo:
1. Insertar 300 µl de muestra de sangre, junto con 900 µl de solución de lisis de globulos rojos y mezclar por inversión; esto se realiza con el objetivo de quedarnos solo con los globulos blancos. Vortexear.
2. Centrifugar por 1 minuto a 14500 rpm
3. Descartar el sobrenadante.
4. Agregar 300 µl solución de lisis de globulos blancos y procurar disolver bien. Romper el coagulo de globulos blancos con pipeta.
5.Agregar la solución desproteinizadora en un volumen de 100 µl y vortexear durante 20 segundos.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
7. Pasar el sobrenadante a otro tubo con isopropanol (300 µl). De esta manera precipita el ADN.
8. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
9. Descartar el sobrenadante; agregar 300 µl de etanol 70% con el objetivo de lavar el ADN. Vortexear.
10. Centrifugar durante 3 minutos a 14500 rpm
11. Sacar el etanol mediante el uso de la centrifugadora en vacío durante 10-15 minutos; o bien dejándolo media hora en la estufa a 37ºc.
12. Rehidratar el ADN con 100 µl de la solución de rehidratación de ADN.
13. Llevar 1 hora a 65ºC o bien toda una noche a 4ºC.
17 de agosto de 2009
Jueves 13 de agosto
Durante la jornada del jueves 13 de agosto, se realizó la preparación de un gel de poliacrilamida, para llevar a cabo una corrida electroforetica. Además, largamos con una segunda PCR, a partir del templado de la primera pcr. Purificamos lo obtenido en esta segunda PCR. También vimos un poco de teoría, y continuamos con la introducción.
Saludos
Saludos
9 de agosto de 2009
Fotos del proyecto
Bueno aca les dejamos algunas fotos del proyecto!!!!
Igualmente para mayor comodidad cuando haya mas posts, las dejamos en el costado, en la sidebar, para que las puedan ver automaticamente cuando entran al blog. Con el transcurso del tiempo iremos subiendo mas fotos.
Saludos!!
Igualmente para mayor comodidad cuando haya mas posts, las dejamos en el costado, en la sidebar, para que las puedan ver automaticamente cuando entran al blog. Con el transcurso del tiempo iremos subiendo mas fotos.
Saludos!!
8 de agosto de 2009
Aclaracion semana 7
Subimos el dia viernes 26 de junio lo realizado el jueves 25 en el marco de la investigacion en el castex, y teoricamente "la entrada se habia publicado correctamente". Al entrar al blog un tiempo despues para actualizarlo observamos que no se habia subido la entrada, probablemente algun problema en el blogger haya sido la causa del error. Es por eso que procedimos a subirla, y corregimos la fecha de acuerdo a la fecha a la que nos referiamos respecto el trabajo en la pasantia. Quisimos aclarar esta desprolijidad.
En los proximos dias estaremos terminando la introduccion al proyecto para entregarla, y subuiremos aca mas fotos del lugar y los aparatos con los que trabajamos, y deteallaremos el metodo de extraccion de ADN comercial.
Saludos!
Buen fin de semana.
Shari y Gaby
En los proximos dias estaremos terminando la introduccion al proyecto para entregarla, y subuiremos aca mas fotos del lugar y los aparatos con los que trabajamos, y deteallaremos el metodo de extraccion de ADN comercial.
Saludos!
Buen fin de semana.
Shari y Gaby
7 de agosto de 2009
Octava semana
Realizamos una segunda PCR para secuenciación--> Marcar los DNTPs con la pre-mix--> amplificar.
Repetimos 25 ciclos:
95ºC -- 95ºC 50ºC 60ºC
10 seg -- 20 seg 15 seg 1 '
Realizamos ds Mix, para dos primers diferentes
H2O 5.5 microlitros
H2O 5.5 microlitros
Primer 3.5 '' ( una con un primer y otra con otro)
Pre mix 2.5 ''
Templado 9 ''
Una vez que finalizó la PCR, realizamos un SPIN--> pequeña centrifugación
y utilizamos nuevamente, al igual que en la séptima semana el KIT DE PURIFICACIÓN.
Mientras esperabamos a que termine la PCR, aprendimos sobre la teoría del secuenciador y comenzamos a realizar la introducción.
Fundamento del secuenciador:
Separa el ADN según su peso molecular; Es una electroforesis en capilar con un polímero especial)
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C
Rojo--> T
Verde--> A
Negro--> G
Cada pico corresponde a un dideoxinucléotido ( el final de una cadena)
Cuando hay dos picos superpuestos (diferentes) hablamos de heterocigocidad, un cambio heterocigota.
Cada pico corresponde a dos alelos, si los dos alelos son diferentes, voy a tener dos colores diferentes.
Luego lo que se hace es comparar la secuencia normal del trozo que quiero estudiar (exón, fragmento).
En nuestro caso, ya hay una secuencia normal publicada, de modo que si al compara es igual que al del paciente, significa que no tiene nada.
Eso fue todo lo realizado el jueves
Saludos!!!
Shar y Gaby
26 de junio de 2009
AL PRINCIPIO:
Realizamos PCR de: 28 AB de normales
La mix: (microlitros)
H2O 62.3
DNTPs 2
DNTPs 2
Buffer 20
Primer1 2.5Primer2 2.5
Mg 2.5
Mg 2.5
Taq 0.2
Muestra: 5
Ciclos:
94ºC --Comienzan los ciclos--94ºC 58ºC 72ºC-- 72ºC 20ºC
3'----------------------------0.30' 1.00' 1.00' --10.00' 5.00'
Luego utilizamos un kit de purificación: "GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"
1ero:PCR A+B--> Purificar con colúmnas
Pcr común: 1-2
Pcr común: 1-2
3-4
5-6
7-8
7-8
2do:Purificar producto-->3ero: 2da PCR para secuenciar
H2O
Primer F Primer R
Pre mix y Templado (1+2)
4to: 2da purificación (alcohólica):
Previo a la purifcación agregamos 2 microlitros de acetato de sodio 1.5M con EDTA
.
Purificación:
-80 microlitros de etanol al 95%
Purificación:
-80 microlitros de etanol al 95%
-Vortexear para que precipite el ADN
-Centrifugar 15' a 14500 Revoluciones
-Descartar sobrenadante
-Lavar con 200 microlitros de etanol al 70%
-Vortexear
-Centrifugar 8' 14500Rev
-Descartamos sobrenadante
-Evaporar el alcohol en centrífuga
-Solubilizamos al ADN que quedó en el fondo mediante el agregado de 15 microlitros de formamida
Ahí ya tengo el ADN listo para secuenciar
Eso fue todo lo que vimos en la semana
Saludos
Gaby y Shar
21 de junio de 2009
6ta semana
Pudimos aprender en qué consiste la técnica de PCR y preparar la muestra de ADN (con la mix), para poderla colocar en el termociclador. Éste aparato, realiza los ciclos en las temperaturas y los tiempos programados de forma exacta.
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:
1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos
2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)
3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.
El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.
Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2
A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.
Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.
Saludos
Gaby y Shari
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:
1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos
2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)
3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.
El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.
Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2
A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.
Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.
Saludos
Gaby y Shari
13 de junio de 2009
5ta semana
En este jueves 11 de junio, realizamos una electroforesis con distintas muestras de ADN, y visualizamos los resultados en rayos Ultravioleta comprobando si habia ADN o no en esas muestras (de las que teoricamente habiamos extraido el ADN por metodo comercial) y en que cantidad. Otro metodo que realizamos con el mismo fin fue realizar una dilucion 1:100 y realizar una espectrofotometria, para con los niveles de absorbancia obtener la concentracion de ADN Como la cuba era de mas volumen realizamos esa dilucion la volvimos a diluir obteniendo asi una dilucion final de 1:200 y las absorbancias obtenidas las mutiplicamos por 2.
Para realizar la electroforesis preparamos el gel del agarosa de la siguiente manera:
40 ml de buffer (10X diluido 1:10)
400 mg de agarosa
Microondas durante 1 minuto.
3 microlitros de colorante (SYBR safe)
Luego lo colocamos en la cubeta con el peine dejandolo solidificar con el peine durante 15 minutos para que se formen las calles, previamente habiamos calibrado con una burbuja, cheuqeando que el gel se solidifque de manera regular a lo largo de la superficie, y sin desniveles. En la electroforesis tambien sembramos productos de PCR (metodo por el cual se amplifica cierto segmento de ADN que uno elige) para comprobar si las enzimas que polimerizan funcionaban todas correctamente (estos productos se habian obtenido a partir de una PCR con distintas TAQpol).
Proximamente subiremos al blog fotos y desarrollaremos el metodo de PCR y la extraccion de ADN comercial.
Saludos
Para realizar la electroforesis preparamos el gel del agarosa de la siguiente manera:
40 ml de buffer (10X diluido 1:10)
400 mg de agarosa
Microondas durante 1 minuto.
3 microlitros de colorante (SYBR safe)
Luego lo colocamos en la cubeta con el peine dejandolo solidificar con el peine durante 15 minutos para que se formen las calles, previamente habiamos calibrado con una burbuja, cheuqeando que el gel se solidifque de manera regular a lo largo de la superficie, y sin desniveles. En la electroforesis tambien sembramos productos de PCR (metodo por el cual se amplifica cierto segmento de ADN que uno elige) para comprobar si las enzimas que polimerizan funcionaban todas correctamente (estos productos se habian obtenido a partir de una PCR con distintas TAQpol).
Proximamente subiremos al blog fotos y desarrollaremos el metodo de PCR y la extraccion de ADN comercial.
Saludos
6 de junio de 2009
Jueves 4 de junio
En el dia jueves 4 de junio, continuamos practicando la extraccion de ADN mediante el metodo comercial, de otros tres pacientes cada uno de nosotros.
Por otra parte, realizamos nuestra primera siembra de electroforesis, que por cuestiones de tiempo no llegamos a ver terminada.
También nos explicaron el metodo de PCR, para obtener copias de ADN, tanto a nivel practico como a nivel teorico.
Esto fue lo realizado en esta ultima jornada.
Saludos
Gaby y Shari
Por otra parte, realizamos nuestra primera siembra de electroforesis, que por cuestiones de tiempo no llegamos a ver terminada.
También nos explicaron el metodo de PCR, para obtener copias de ADN, tanto a nivel practico como a nivel teorico.
Esto fue lo realizado en esta ultima jornada.
Saludos
Gaby y Shari
29 de mayo de 2009
Jueves 28 de mayo
Durante el Jueves 28 de mayo, Adriana nos explicó cómo realizar una correcta extracción de ADN, utilizando el método comercial.
De modo que pudimos realizar, cada uno y por duplicado, 2 extracciones de ADN de sangre de pacientes en los cuales en ciertos análisis previos algúnos de los valóres del Ag, el Cofactor y/o del Kptt, no resultaban normales.
Por otra parte, estuvimos investigando un Programa creador de Primers, en base al Exón 52, así aprendíamos su funcionamiento y intentábamos de crear un primer que tenga las condiciones más óptimas posibles.
A su vez, Adriana continuó explicándonos teoría sobre lo que haríamos el próximo jueves, centrándose en cómo controlar que el ADN que obtuvimos nos es útil para los análisis que queremos realizar.
Esto fue lo que hicimos en éste último jueves.
Saludos
Gaby y Shari
De modo que pudimos realizar, cada uno y por duplicado, 2 extracciones de ADN de sangre de pacientes en los cuales en ciertos análisis previos algúnos de los valóres del Ag, el Cofactor y/o del Kptt, no resultaban normales.
Por otra parte, estuvimos investigando un Programa creador de Primers, en base al Exón 52, así aprendíamos su funcionamiento y intentábamos de crear un primer que tenga las condiciones más óptimas posibles.
A su vez, Adriana continuó explicándonos teoría sobre lo que haríamos el próximo jueves, centrándose en cómo controlar que el ADN que obtuvimos nos es útil para los análisis que queremos realizar.
Esto fue lo que hicimos en éste último jueves.
Saludos
Gaby y Shari
23 de mayo de 2009
Primeras dos jornadas en el Instituto de Investigaciones Hematólogicas de la Academia Nacional de Medicina.
A lo largo de la primera jornada llevada a cabo en el Instituto el día 14 de mayo, nos introducimos en la enfermedad de Von Willerbrand. Nuestra investigadora, Adriana Woods , nos explico la importancia del factor Von Willerbrand en la coagulación de la sangre y sus características, así como todo los procesos llevados a cabo en la cascada de coagulación. Aprendimos acerca de los motivos por los cuales puede producirse la enfermedad, asi como sus consecuencias y los tipos de analisis que se realizan en una persona que presenta sintomas acordes a la enfermedad, asi como también aprendimos como interpretar los resultados. También aprendimos los distintos tipos de enfermedad.
En la segunda jornada, el 21 de mayo, Adriana explicó todo lo que tenemos que saber para realizar una apropiada extracción de ADN, acción que haremos en las semanas venideras.
Esto fue lo realizado en las primeras dos jornadas, de caracter teórico.
Saludos
Shari y Gaby
En la segunda jornada, el 21 de mayo, Adriana explicó todo lo que tenemos que saber para realizar una apropiada extracción de ADN, acción que haremos en las semanas venideras.
Esto fue lo realizado en las primeras dos jornadas, de caracter teórico.
Saludos
Shari y Gaby
22 de abril de 2009
Apertura Blog 2009, proyecto final quimica
Hola a todos, queda abierto el blog de la pasantía a realizarse en el Instituto hematologico Mariano Castex, acerca de la enfermedad de Von Willebrand, durante el transcurso del ciclo lectivo 2009. Quienes llevaremos a cabo la investigaciòn y mantendremos actualizado el blog seremos Sharon Fingier y Gabriel Slubsci, alumnos de 6to bto de la orientación de química.
Cordialmente
Shari y gaby
Cordialmente
Shari y gaby
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