AL PRINCIPIO:

Realizamos PCR de: 28 AB de normales

La mix: (microlitros)

H2O 62.3
DNTPs 2

Buffer 20

Primer1 2.5

Primer2 2.5
Mg 2.5

Taq 0.2

Muestra: 5

Ciclos:

94ºC --Comienzan los ciclos--94ºC 58ºC 72ºC-- 72ºC 20ºC

3'----------------------------0.30' 1.00' 1.00' --10.00' 5.00'

Luego utilizamos un kit de purificación: "GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"

1ero:PCR A+B--> Purificar con colúmnas
Pcr común: 1-2

3-4

5-6
7-8

2do:Purificar producto-->3ero: 2da PCR para secuenciar

H2O

Primer F Primer R

Pre mix y Templado (1+2)

4to: 2da purificación (alcohólica):

Previo a la purifcación agregamos 2 microlitros de acetato de sodio 1.5M con EDTA

.

Purificación:

-80 microlitros de etanol al 95%

-Vortexear para que precipite el ADN

-Centrifugar 15' a 14500 Revoluciones

-Descartar sobrenadante

-Lavar con 200 microlitros de etanol al 70%

-Vortexear

-Centrifugar 8' 14500Rev

-Descartamos sobrenadante

-Evaporar el alcohol en centrífuga

-Solubilizamos al ADN que quedó en el fondo mediante el agregado de 15 microlitros de formamida

Ahí ya tengo el ADN listo para secuenciar

Eso fue todo lo que vimos en la semana

Saludos

Gaby y Shar