6ta semana

Pudimos aprender en qué consiste la técnica de PCR y preparar la muestra de ADN (con la mix), para poderla colocar en el termociclador. Éste aparato, realiza los ciclos en las temperaturas y los tiempos programados de forma exacta.
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:

1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos

2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)

3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.

Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.

El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.

Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2

A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.

Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.

Saludos
Gaby y Shari