Octava semana

Realizamos una segunda PCR para secuenciación--> Marcar los DNTPs con la pre-mix--> amplificar.

Repetimos 25 ciclos:

95ºC -- 95ºC 50ºC 60ºC

10 seg -- 20 seg 15 seg 1 '

Realizamos ds Mix, para dos primers diferentes
H2O 5.5 microlitros

Primer 3.5 '' ( una con un primer y otra con otro)

Pre mix 2.5 ''

Templado 9 ''

Una vez que finalizó la PCR, realizamos un SPIN--> pequeña centrifugación

y utilizamos nuevamente, al igual que en la séptima semana el KIT DE PURIFICACIÓN.

Mientras esperabamos a que termine la PCR, aprendimos sobre la teoría del secuenciador y comenzamos a realizar la introducción.

Fundamento del secuenciador:

Separa el ADN según su peso molecular; Es una electroforesis en capilar con un polímero especial)
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C

Rojo--> T

Verde--> A

Negro--> G

Cada pico corresponde a un dideoxinucléotido ( el final de una cadena)

Cuando hay dos picos superpuestos (diferentes) hablamos de heterocigocidad, un cambio heterocigota.

Cada pico corresponde a dos alelos, si los dos alelos son diferentes, voy a tener dos colores diferentes.

Luego lo que se hace es comparar la secuencia normal del trozo que quiero estudiar (exón, fragmento).

En nuestro caso, ya hay una secuencia normal publicada, de modo que si al compara es igual que al del paciente, significa que no tiene nada.

Eso fue todo lo realizado el jueves

Saludos!!!

Shar y Gaby