Jueves 13 de agosto

Durante la jornada del jueves 13 de agosto, se realizó la preparación de un gel de poliacrilamida, para llevar a cabo una corrida electroforetica. Además, largamos con una segunda PCR, a partir del templado de la primera pcr. Purificamos lo obtenido en esta segunda PCR. También vimos un poco de teoría, y continuamos con la introducción.

Saludos

Fotos del proyecto

Bueno aca les dejamos algunas fotos del proyecto!!!!
Igualmente para mayor comodidad cuando haya mas posts, las dejamos en el costado, en la sidebar, para que las puedan ver automaticamente cuando entran al blog. Con el transcurso del tiempo iremos subiendo mas fotos.

Saludos!!

Aclaracion semana 7

Subimos el dia viernes 26 de junio lo realizado el jueves 25 en el marco de la investigacion en el castex, y teoricamente "la entrada se habia publicado correctamente". Al entrar al blog un tiempo despues para actualizarlo observamos que no se habia subido la entrada, probablemente algun problema en el blogger haya sido la causa del error. Es por eso que procedimos a subirla, y corregimos la fecha de acuerdo a la fecha a la que nos referiamos respecto el trabajo en la pasantia. Quisimos aclarar esta desprolijidad.
En los proximos dias estaremos terminando la introduccion al proyecto para entregarla, y subuiremos aca mas fotos del lugar y los aparatos con los que trabajamos, y deteallaremos el metodo de extraccion de ADN comercial.

Saludos!

Buen fin de semana.

Shari y Gaby

Octava semana

Realizamos una segunda PCR para secuenciación--> Marcar los DNTPs con la pre-mix--> amplificar.

Repetimos 25 ciclos:

95ºC -- 95ºC 50ºC 60ºC

10 seg -- 20 seg 15 seg 1 '

Realizamos ds Mix, para dos primers diferentes
H2O 5.5 microlitros

Primer 3.5 '' ( una con un primer y otra con otro)

Pre mix 2.5 ''

Templado 9 ''

Una vez que finalizó la PCR, realizamos un SPIN--> pequeña centrifugación

y utilizamos nuevamente, al igual que en la séptima semana el KIT DE PURIFICACIÓN.

Mientras esperabamos a que termine la PCR, aprendimos sobre la teoría del secuenciador y comenzamos a realizar la introducción.

Fundamento del secuenciador:

Separa el ADN según su peso molecular; Es una electroforesis en capilar con un polímero especial)
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C

Rojo--> T

Verde--> A

Negro--> G

Cada pico corresponde a un dideoxinucléotido ( el final de una cadena)

Cuando hay dos picos superpuestos (diferentes) hablamos de heterocigocidad, un cambio heterocigota.

Cada pico corresponde a dos alelos, si los dos alelos son diferentes, voy a tener dos colores diferentes.

Luego lo que se hace es comparar la secuencia normal del trozo que quiero estudiar (exón, fragmento).

En nuestro caso, ya hay una secuencia normal publicada, de modo que si al compara es igual que al del paciente, significa que no tiene nada.

Eso fue todo lo realizado el jueves

Saludos!!!

Shar y Gaby

AL PRINCIPIO:

Realizamos PCR de: 28 AB de normales

La mix: (microlitros)

H2O 62.3
DNTPs 2

Buffer 20

Primer1 2.5

Primer2 2.5
Mg 2.5

Taq 0.2

Muestra: 5

Ciclos:

94ºC --Comienzan los ciclos--94ºC 58ºC 72ºC-- 72ºC 20ºC

3'----------------------------0.30' 1.00' 1.00' --10.00' 5.00'

Luego utilizamos un kit de purificación: "GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"

1ero:PCR A+B--> Purificar con colúmnas
Pcr común: 1-2

3-4

5-6
7-8

2do:Purificar producto-->3ero: 2da PCR para secuenciar

H2O

Primer F Primer R

Pre mix y Templado (1+2)

4to: 2da purificación (alcohólica):

Previo a la purifcación agregamos 2 microlitros de acetato de sodio 1.5M con EDTA

.

Purificación:

-80 microlitros de etanol al 95%

-Vortexear para que precipite el ADN

-Centrifugar 15' a 14500 Revoluciones

-Descartar sobrenadante

-Lavar con 200 microlitros de etanol al 70%

-Vortexear

-Centrifugar 8' 14500Rev

-Descartamos sobrenadante

-Evaporar el alcohol en centrífuga

-Solubilizamos al ADN que quedó en el fondo mediante el agregado de 15 microlitros de formamida

Ahí ya tengo el ADN listo para secuenciar

Eso fue todo lo que vimos en la semana

Saludos

Gaby y Shar

6ta semana

Pudimos aprender en qué consiste la técnica de PCR y preparar la muestra de ADN (con la mix), para poderla colocar en el termociclador. Éste aparato, realiza los ciclos en las temperaturas y los tiempos programados de forma exacta.
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:

1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos

2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)

3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.

Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.

El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.

Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2

A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.

Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.

Saludos
Gaby y Shari