Subimos el dia viernes 26 de junio lo realizado el jueves 25 en el marco de la investigacion en el castex, y teoricamente "la entrada se habia publicado correctamente". Al entrar al blog un tiempo despues para actualizarlo observamos que no se habia subido la entrada, probablemente algun problema en el blogger haya sido la causa del error. Es por eso que procedimos a subirla, y corregimos la fecha de acuerdo a la fecha a la que nos referiamos respecto el trabajo en la pasantia. Quisimos aclarar esta desprolijidad.
En los proximos dias estaremos terminando la introduccion al proyecto para entregarla, y subuiremos aca mas fotos del lugar y los aparatos con los que trabajamos, y deteallaremos el metodo de extraccion de ADN comercial.
Saludos!
Buen fin de semana.
Shari y Gaby
8 de agosto de 2009
7 de agosto de 2009
Octava semana
Realizamos una segunda PCR para secuenciación--> Marcar los DNTPs con la pre-mix--> amplificar.
Repetimos 25 ciclos:
95ºC -- 95ºC 50ºC 60ºC
10 seg -- 20 seg 15 seg 1 '
Realizamos ds Mix, para dos primers diferentes
H2O 5.5 microlitros
H2O 5.5 microlitros
Primer 3.5 '' ( una con un primer y otra con otro)
Pre mix 2.5 ''
Templado 9 ''
Una vez que finalizó la PCR, realizamos un SPIN--> pequeña centrifugación
y utilizamos nuevamente, al igual que en la séptima semana el KIT DE PURIFICACIÓN.
Mientras esperabamos a que termine la PCR, aprendimos sobre la teoría del secuenciador y comenzamos a realizar la introducción.
Fundamento del secuenciador:
Separa el ADN según su peso molecular; Es una electroforesis en capilar con un polímero especial)
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C
Esta técnica permite conocer la secuencia en orden de los nucleótidos.
Los productos que se obtienen luego de la segunda purificación se pasan a un tubo especial para secuenciación y esas serán las muestras que se harán correr a través de un capilar con polímero.
El capilar tiene una pequeña “ventana” por donde deja pasar el rayo laser. El polímero se encuentra en una jeringa y entre muestra y muestra se vacía el polímero, se lava el capilar con agua y buffer y luego se vuelve a cargar el polímero. Una vez que se llenó el capilar con el polímero, aspira la muestra y por campo eléctrico se produce la electrforesis de la muestra, dentro del capilar. Este secuenciador se basa en un sistema automatizado de electroforesis capilar (los fragmentos de ADN migran a través del capilar de acuerdo a su tamaño, primero los más pequeños y luego los más grandes).
El mecanismo de lectura de las secuencias realizado hace que sean necesarias dos muestras por exón, una utilizando el primer Forward y otra con el primer Reverse.
Las muestras se hacen pasar por un capilar con un polímero. El láser incide en el capilar y registra los tintes fluorescentes, el cual cada color corresponde a una base. Es decir, el cromóforo (el dídioxinucléotido está al final de la cadena marcado por un cromóforo) va a emitir color.
Azul--> C
Rojo--> T
Verde--> A
Negro--> G
Cada pico corresponde a un dideoxinucléotido ( el final de una cadena)
Cuando hay dos picos superpuestos (diferentes) hablamos de heterocigocidad, un cambio heterocigota.
Cada pico corresponde a dos alelos, si los dos alelos son diferentes, voy a tener dos colores diferentes.
Luego lo que se hace es comparar la secuencia normal del trozo que quiero estudiar (exón, fragmento).
En nuestro caso, ya hay una secuencia normal publicada, de modo que si al compara es igual que al del paciente, significa que no tiene nada.
Eso fue todo lo realizado el jueves
Saludos!!!
Shar y Gaby
26 de junio de 2009
AL PRINCIPIO:
Realizamos PCR de: 28 AB de normales
La mix: (microlitros)
H2O 62.3
DNTPs 2
DNTPs 2
Buffer 20
Primer1 2.5Primer2 2.5
Mg 2.5
Mg 2.5
Taq 0.2
Muestra: 5
Ciclos:
94ºC --Comienzan los ciclos--94ºC 58ºC 72ºC-- 72ºC 20ºC
3'----------------------------0.30' 1.00' 1.00' --10.00' 5.00'
Luego utilizamos un kit de purificación: "GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit"
1ero:PCR A+B--> Purificar con colúmnas
Pcr común: 1-2
Pcr común: 1-2
3-4
5-6
7-8
7-8
2do:Purificar producto-->3ero: 2da PCR para secuenciar
H2O
Primer F Primer R
Pre mix y Templado (1+2)
4to: 2da purificación (alcohólica):
Previo a la purifcación agregamos 2 microlitros de acetato de sodio 1.5M con EDTA
.
Purificación:
-80 microlitros de etanol al 95%
Purificación:
-80 microlitros de etanol al 95%
-Vortexear para que precipite el ADN
-Centrifugar 15' a 14500 Revoluciones
-Descartar sobrenadante
-Lavar con 200 microlitros de etanol al 70%
-Vortexear
-Centrifugar 8' 14500Rev
-Descartamos sobrenadante
-Evaporar el alcohol en centrífuga
-Solubilizamos al ADN que quedó en el fondo mediante el agregado de 15 microlitros de formamida
Ahí ya tengo el ADN listo para secuenciar
Eso fue todo lo que vimos en la semana
Saludos
Gaby y Shar
21 de junio de 2009
6ta semana
Pudimos aprender en qué consiste la técnica de PCR y preparar la muestra de ADN (con la mix), para poderla colocar en el termociclador. Éste aparato, realiza los ciclos en las temperaturas y los tiempos programados de forma exacta.
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:
1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos
2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)
3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.
El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.
Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2
A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.
Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.
Saludos
Gaby y Shari
Al programarlo, hay una etapa inicial, una final y durante cada ciclo hay 3 etapas intermedias.
La etapa inicial va a ser a 94ºC durante unos 3-5 minutos para asegurarnos que comienza el proceso de desnaturalización del ADN.
Luego, van a empezar los ciclos:
1-Desnaturalización: Es una etapa crítica ya que en ella, el ADN molde se desnaturaliza completamente. La temperatura utilizada es a los 95ºC durante 30 segundos
2- Hibridación: Esta etapa suele llamarse “fase de annealing o de emparejamiento”. Una vez que el ADN se desnaturalizó, se disminuye la temperatura hasta un rango entre 40ºC y 60ºC . En ésta etapa, los primers se van unir a las hebras de ADN. La temperatura óptima de hibridación (Tm) va a depender de varios factores y es específica para cada primer. Una fórmula simple para calcular la Tm es:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T)
3- Extensión: Durante ésta etapa, la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3’del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada. La temperatura en la que se va a llevar a cabo este paso suele de 72 +/- 5º C ya que a este rango de temperatura la taq polimerasa alcanza su máxima actividad.
Por último, ocurre la etapa final de alargamiento, a los 72º C durante unos 7-10 minutos.
El número de los ciclos depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de los factores han sido optimizados. En nuestro caso, realizamos 35 ciclos.
Procedimiento de la master MIX:
Se prepara la Master Mix en las siguientes proporciones: (microlitros)
H20 65.3
DNTPs 2
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Buffer 20
Mg 2.5
Taq polimerasa 0.2
A la Mix, se le agrega la muestra de ADN 5 microlitros.
Ahora se coloca la muestre en el termociclador e introducimos la información de los ciclos.
Por otra parte, comenzamos a ver un poco de teoría sobre lo que vamos hacer en la próxima semana.
Saludos
Gaby y Shari
13 de junio de 2009
5ta semana
En este jueves 11 de junio, realizamos una electroforesis con distintas muestras de ADN, y visualizamos los resultados en rayos Ultravioleta comprobando si habia ADN o no en esas muestras (de las que teoricamente habiamos extraido el ADN por metodo comercial) y en que cantidad. Otro metodo que realizamos con el mismo fin fue realizar una dilucion 1:100 y realizar una espectrofotometria, para con los niveles de absorbancia obtener la concentracion de ADN Como la cuba era de mas volumen realizamos esa dilucion la volvimos a diluir obteniendo asi una dilucion final de 1:200 y las absorbancias obtenidas las mutiplicamos por 2.
Para realizar la electroforesis preparamos el gel del agarosa de la siguiente manera:
40 ml de buffer (10X diluido 1:10)
400 mg de agarosa
Microondas durante 1 minuto.
3 microlitros de colorante (SYBR safe)
Luego lo colocamos en la cubeta con el peine dejandolo solidificar con el peine durante 15 minutos para que se formen las calles, previamente habiamos calibrado con una burbuja, cheuqeando que el gel se solidifque de manera regular a lo largo de la superficie, y sin desniveles. En la electroforesis tambien sembramos productos de PCR (metodo por el cual se amplifica cierto segmento de ADN que uno elige) para comprobar si las enzimas que polimerizan funcionaban todas correctamente (estos productos se habian obtenido a partir de una PCR con distintas TAQpol).
Proximamente subiremos al blog fotos y desarrollaremos el metodo de PCR y la extraccion de ADN comercial.
Saludos
Para realizar la electroforesis preparamos el gel del agarosa de la siguiente manera:
40 ml de buffer (10X diluido 1:10)
400 mg de agarosa
Microondas durante 1 minuto.
3 microlitros de colorante (SYBR safe)
Luego lo colocamos en la cubeta con el peine dejandolo solidificar con el peine durante 15 minutos para que se formen las calles, previamente habiamos calibrado con una burbuja, cheuqeando que el gel se solidifque de manera regular a lo largo de la superficie, y sin desniveles. En la electroforesis tambien sembramos productos de PCR (metodo por el cual se amplifica cierto segmento de ADN que uno elige) para comprobar si las enzimas que polimerizan funcionaban todas correctamente (estos productos se habian obtenido a partir de una PCR con distintas TAQpol).
Proximamente subiremos al blog fotos y desarrollaremos el metodo de PCR y la extraccion de ADN comercial.
Saludos
6 de junio de 2009
Jueves 4 de junio
En el dia jueves 4 de junio, continuamos practicando la extraccion de ADN mediante el metodo comercial, de otros tres pacientes cada uno de nosotros.
Por otra parte, realizamos nuestra primera siembra de electroforesis, que por cuestiones de tiempo no llegamos a ver terminada.
También nos explicaron el metodo de PCR, para obtener copias de ADN, tanto a nivel practico como a nivel teorico.
Esto fue lo realizado en esta ultima jornada.
Saludos
Gaby y Shari
Por otra parte, realizamos nuestra primera siembra de electroforesis, que por cuestiones de tiempo no llegamos a ver terminada.
También nos explicaron el metodo de PCR, para obtener copias de ADN, tanto a nivel practico como a nivel teorico.
Esto fue lo realizado en esta ultima jornada.
Saludos
Gaby y Shari
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